十万级制药厂GMP无尘车间净化工程

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单抗下游生产工艺简介
下游生产工艺即为单克隆抗体纯化的过程。在单抗药物的生产过程中，多采用色谱法进行产品与杂质的分离纯化。色谱又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等的差别,当两
相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。1906年Tswett研究植物色素分离时提出色谱法概念;他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。按光谱的命名方式，这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。按照固定相形状可将色谱法分为柱色谱、纸色谱及薄层色谱法。
（1）单克隆抗体生产中常用的纯化方法
1亲和层析法    粗提纯化当中常用到的纯化方法。利用生物分子之间的专一识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和分离技术。在该技术中，亲和分离过程是通过引人亲和配基得以实现所谓亲和配基，是指具有对生物分子专一识别性或特异相互作用的物质。将亲和配基固定在不同的介质上，可实现不同的亲和分离技术，如固定在层析介质上，达到专一性层析分离的技术称为亲和层析技术。将亲和配基接在分离膜上，实现亲和膜分离技术。目前常用到的亲和层析填料有Darotwie A Conhorose Protein G Sepharose、Mab-Select、 MabSelect Xtra、 MabSelect Sure等。
2疏水层析法    疏水层析(Udonhohic Interaction ChromatograDhv, HIC)法是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和杂质的一种较为常用的方法。蛋白质的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这此疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由干疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质等生物大分子的。常用到的层析填料主要有Phenyl Sepharose FF、Octyl Sepharose FF、Buty Sepharose FF等。精制纯化常用到此方法。
3离子交换层析法    离子交换层析（Ion Exchange Chromatography
IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。
常用的离子交换层析的填料有Capto Family 系列、DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、SP Sepharose FF、CM Sepharose FF等。
4超滤浓缩    超滤（Ultrafiltration)技术是一种膜滤法，也有错流过滤（Cross Filtra-tion)之称。它能从周围含有微粒的介质中分离出10～100A的微粒，这个尺寸范围内的微粒，通常是指液体内的溶质。其基本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过,大分子物质和微粒子,如蛋白质、水溶性高聚物、等被滤膜阻留，从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。
（2）单克隆抗体纯化策略
每个单抗等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解个性，从而制定相应的幼化等略同时也针对不同抗体和其生产宿主的特性制定纯化策略。

制药工艺验证
工艺验证是为与产品制造相关的人员、材料、设备、方法、环境条件以及其他有关公用设施的组合可以始终如一地生产出符合企业内控标准及国家法定标准的产品，工艺稳定可靠，符合GMP要求。本文从原料药、口服固体制剂、无菌制剂、生物制品和的生产工艺特点分别讲行阐述,强调“基于风险分析”的工艺验证执行。
一.原料药工艺验证
本节采用了ICH Q7中的关键概念和定义。
（1）原料药（Active Pharmaceutical Ingredient， API)
原料药是指在用于药品制造中的任何一种物质或物质的混合物，而且在制药时成为药品的一种活性成分。此种物质在疾病的诊断、、缓解、处理或疾病预防中有药理活性或其他直接作用,或能影响机体的功能和结构。
（2）中间体（Intermediate)
中间体是原料药工艺步骤中产生的、必须经过进一步分子变化或精制才能成为原料药的一种物料。中间体可以分离或不分离。
（3）物料（Material)
物料是原料（起始物料、试剂、溶剂)、工艺用品、中间体、原料药、包装及贴签材料的统称。
（4）非无菌原料药（Non-Sterile API)
非无菌原料药法定药品标准中未列无菌检查项目的原料药。
（5）无菌原料药（Sterile API)
无菌原料药法定药品标准中列有无菌检查项目的原料药，需要对可能引起微粒、微生物和内的潜在污染讲行严格控制。

口服固体制剂工艺流程概述一
片剂生产工艺流程包括原辅料预处理、配料、制粒、干燥、整粒、混合、压片、包衣以及内包装、外包装等步骤，以A产品生产工艺为例。
1.原辅料前处理
原辅料使用前应目检、核对毛重。液体原料必要时应过滤，以除去异物。
原辅料前处理包括粉碎和过筛。粉碎的目的在于减小粒径，增加比表面积，有利于提高难溶性药物的溶出度和生物利用度，有利于制剂中各成分混合均匀;过筛的目的是获得较均匀的物料，对提高混合均匀度、颗粒的流动性，保证重量差异、片剂的硬度,减少裂片等具有明显的效果。
随着供应商原辅料加工工艺以及生产工艺水平的提高，某些产品生产工艺不需要对原辅料进行粉碎与过筛，粉碎与过筛等预处理操作会带来交叉污染的风险，应尽可能避免。
2. 配料
按生产进行API和辅料的称量，配料前应按领料单先核对原辅料品名、规格、代码、批号、生产厂、包装情况。计算、称量及投料必须复核，操作者及复核者均应在记录上签名。
手工配料目前大多在称量罩下进行,也可采用自动的机械配料系统，完成物料的称量过程。
3.制粒
（1）干混
API和辅料按规定时间采用干混的方式混合均匀。
（2）黏合剂的制备
黏合剂常由黏合剂物料和润湿剂配制而成。黏合剂可以作为架桥．靠黏性使混合均匀的物料聚结成粒，干燥时黏合剂中的溶剂蒸发，残留的黏合剂固结成固体架桥，常用的润湿液有水和。
（3）制粒
制粒时，必须按规定将原辅料混合均匀，加入黏合剂，对主药含量小的品种应按药物的性质用适宜的方法使药物均匀度符合规定，一个批号分几次制粒时,颗粒的松紧要一致。
采用高速湿法混合颗粒机制粒时，按工艺要求设定干混、湿混时间以及揽拌桨和制粒刀的速度与加人黏合剂的量。当混合制粒结束时，彻底将混合益的内壁、揽拌桨和盖子上的物料擦刮干净,以减少损失,*交叉污染的风险。
对黏合剂的品种、温度、浓度、数量、流化喷雾法制粒的喷雾、颗粒翻腾状态以及干燥制粒的压力等技术条件,必须按品种特点制定必要的技术参数，严格控制操作。

单克隆抗体药物的生产原液工艺验证部分要点
根据单抗各工艺参数对产品质量的影响情况进行风险评估，确定工艺参数的风险级别及关键工艺参数，并对关键工艺参数进行验证。工艺验证将至少成功连续生产3批产品，以工艺过程的可靠性和重现性。验证批次的数量应能够保证统计学置信区间的需求，在验证过程中应尽可能多点高频率取样，以获得足够多的信息支持验证结论。具体的验证过程如下。
（1）细胞复苏过程
细胞复苏过程主要控制培养温度、培养基pH、摇瓶转速、培养时间等参数。主要的质量属性是细胞生长状态，另外需要控制的是外源微生物的污染。
（2）生物反应器扩增
前面介绍生物反应器的控制逻辑符合PAT 要求，因此，设**的控制一般考虑温度、反应器转速、pH、 CO2压力、O2压力、N2压力等参数。主要的质量属性是细胞生产状态和扩增速度、细胞密度、细胞活性等，同时需要注意外源微生物污染。
（3）澄清过滤
过滤过程的压力、流速等会决定工艺持续过程,有些产品需要考虑过滤过程的环境温度对目标蛋白质的影响，所以温度也有可能需要控制。主要的质量属性为澄清过滤后的澄清液中无细胞或细胞碎片。
（4）粗纯
粗纯工艺的目的是去除宿主蛋白质等杂质，通常采用层析的方法。本过程需要注意的是层析缓冲液的浓度、pH、流速、纯化过程环境温度、保留时间、紫外检测的峰型、收峰时间等参数，主要的质量属性是杂蛋白质去除的效果和目的蛋白质的浓度和产量等。
（5）去病毒
去病毒的工艺验证应在工艺验证工作之前进行，可以在此步骤进行病毒检测。
（6）精制
精制的目的是进一步提高目的蛋白质的纯度，通常采用层析方法，如分子筛等。所以输入的条件与粗纯是一致的，不过质量属性中，应确定目的蛋白质的纯度和杂质的含量，如使用 ELISA 或 SDA-PAGE或 HPLC等方法进行检测。
（7）除菌过滤
除菌过滤过程的前提是过滤器完整性检测合格，过程中需要控制过滤压力、流量等，质量属性即无菌检查结果。因为这步操作结束后即为原液，因此会在此步结束后按照原液质量标准进行全检。
单克隆抗体生产工艺验证实施执行时，要按照已批准的生产工艺验证方案讲行单克隆抗体生产工艺的验证。工艺验证的批次至少保证3批。此外,还应注意:
⑴操作人员按单克降抗体药物的生产工艺规程进程操作，生产工艺规程要对所要求的工作进行充分描述;
⑵在工艺验证过程中对所列出的关键工艺参数进行检查确认;
⑶根据工艺过程及产品质量标准确定的取样计划，合理安排人员进行生产产品的取样，可以根据统计分析样本量需求安排取样计划;
⑷生产工艺结束后，应按文件规定对产品进行成品检验，检验结果应符合成品质量标准,将统计结果记入测试数据表中;
⑸据验证检验结果,对工艺验证结果的各步骤进行总结。
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