pcr扩增实验室工程

中净环球净化可提供医学实验室、PCR实验室的咨询、规划、设计、施工、安装改造等配套服务。
核酸检测实验室质量控制
（一）性能验证。在用于标本检测前，实验室应对由提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成检测系统进行必要的性能验证，性能指标包括但不限于精密度（至少要有重复性）和检测限。建议选用高灵敏的试剂（检测限≤500拷贝/mL）。
（二）室内质控。实验室应按照《卫生健康委办公厅关于医疗机构开展核酸检测有关要求的通知》（国卫办医函〔2020〕53号）要求规范开展室内质控。每批检测至少有1份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的1.5-3倍）、3份阴性质控品（生理盐水）。质控品随机放在标本中，参与从提取到扩增的全过程。在大规模人群筛查时，因人群流行率低（<0.1%），一旦出现阳性结果，对阳性标本采用另外一到两种更为灵敏且扩增不同区域的核酸检测试剂对原始标本进行复核检测，复核阳性方可报出。
（三）室间质评。实验室应参加或省级检验中心组织的室间质评。对检测量大以及承担人群筛查等任务的实验室，要适当增加室间质评频率。
六、核酸检测实验室核酸检测结果反馈基本要求
（一）报告时限。对于发热、急诊患者，在6小时内报告核酸检测结果；对于普通、住院患者及陪护人员等人群，原则上在12小时内报告结果；对于“愿检尽检”人群，一般在内报告结果。医疗机构应当为受检者出具，并告知其查询方式。
（二）。医疗机构可采用纸质、快递、网络或信息化系统等多种形式，发放核酸，并注意保护个人隐私。发现核酸检测阳性结果时应按相关要求在规定时间内报告。

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实验室医疗废物管理。
1.基本要求。实验室应当制定医疗废物处置程序及污物、污水处理操作程序。所有的危险性医疗废物必须按照统一规格化的容器和标示方式，完整且合规示废物内容。应当由经过适当培训的人员使用适当的个人防护装备和设备处理危险性医疗废物。实验室应建立医疗废物处理记录，定期对实验室排风HEPA过滤器进行更换，定期对处理后的污水进行监测，采用生物指示剂监测压力效果。
2.医疗废物的处理措施。医疗废物的处理是控制实验室的关键环节，必须充分掌握生物废弃物的分类，并严格执行相应的处理程序。
（1）废液的处理。实验室产生的废液可分为普通污水和感染性废液。普通污水产生于洗手池等设备，对此类污水应当排入实验室水处理系统，经统一处理达标后进行排放。感染性废液即在实验操作过程中产生的废液，需采用化学（0.55%含氯剂处理）或物理（紫外照射30分钟以上）方式处理，确认灭活后方可排入实验室水处理系统，经统一处理达标后进行排放。污水处理效果按GB18466《医疗机构水污染物排放标准》相关规定进行评价。
（2）固体废物的处理。实验室固体废物应当分类收集。固体废物的收集容器应当具有不易破裂、防渗漏、耐湿耐热、可密封等特性。实验室内的潜在感染性废物不允许堆积存放，应当及时进行压力蒸汽处理。废物处置之前，应当存放在实验室内的位置。小型固体废物如检测耗材、个人防护装备等均需使用双层防渗漏包装袋打包密封后经过压力蒸汽处理，再转运出实验室。
体积较大的固体废物如HEPA过滤器，应当由人士进行原位后，装入容器内进行。不能进行压力蒸汽的物品如电子设备可采用环氧乙烷熏蒸处理。经处理后移出实验室的固体废物需集中交由医疗废物处理单位进行处置。

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PCR实验室建立方法
1、建立样品准备区
这个区域用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：⑴PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。⑵组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。⑶用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA样品应该用有的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶。⑸大体积样品应该用单包装的无菌一次性移液管吸取。⑹管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。⑺任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要用于样品准备间，经常清洗。
2、样品准备和RNA-PCR 
RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。
3、建立前PCR区
该去用于准备各种反应，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是用于前PCR区的正压活塞式移液管。
4、PCR实验室试剂的操作
⑴所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。⑵所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压。⑶在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。⑷所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。⑸所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性的瓶子和管子。⑹新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。⑺样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
5、在前PCR区建立PCR混合物
⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。⑵如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够的PCR成分。⑶作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以里面不含扩增抑制物。⑷阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。⑸当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用少数量的核酸。⑹由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。
6、控制污染的方法
已设计出很有力的酶学方法用来一种形式的污染-使用UNG，这一技术能有效地由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全污染问题，但可以将污染降低几个数量级。
7、后PCR区PCR完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动。

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PCR实验室污染后的处理措施
污染，是PCR实验室出现实验假阳性、结果不可信的重要原因，PCR实验室应当将防污染作为日常管理、实验安排、清洁、实验习惯的核心。PCR 实验污染和细胞污染是有差别的，PCR 实验污染主要是核酸而不是和其他入侵者。因此所有的预防措施都会稍稍有所不同。“易查不易察”，污染来的悄无声息，我们该如何应对？下文简单介绍一下PCR实验室的主要污染来源、实验中如何避免和减少污染的可能性及实验发生污染的应急处理方案。
一、PCR实验室的污染来源
1、样本间交叉污染：
收集样本的容器被污染或样本密封不严外溢；不同样本移液时忘记更换尖或未使用带滤芯尖；移液器等实验器具及耗材未及时；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。
2、实验试剂污染：
主要是在 PCR 组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。加样过程中，因为 PCR 试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得 PCR 试剂和 PCR 板/管处于 0℃，但这个过程也是充满了污染的风险的。
3、扩增产物污染：
大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖，这是 PCR 反应中主要常见的污染问题。因为 PCR 产物拷贝量大，远远** PCR 检测数个拷贝的限，所以微量的 PCR 产物污染，可形成假阳性。
4、克隆质粒污染：
作为阳性质控品的克隆质粒外溢。
二、PCR实验室的防污染方法
按照实验室的工作制度或标准操作程序，所有操作符合《实验室生物通用要求》（GB19489-2008）。
1、严格执行各区功能划分：
试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。
标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及样本的操作，应符合生物二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。
扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。
扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性液相分析、测序等。
试剂准备区、样本制备区和扩增区内的实验用品，包括移液器等器具应，空气、物品流向依次为：试剂准备区、样本制备区、扩增区、产物分析区，不可逆行。
2、清洁的实验用品：
实验室自配试剂（去离子水、缓冲液等）和所有使用器具在使用之前均应高压或紫外。尖、反应管等实验耗材应一次性使用。
3、正确的实验操作：
实验应在**净工作台内进行，工作台内应放置PCR的微量离心机、各量程的移液器和其他必须物品。
实验的过程中选择合适尺寸的手套并能及时更换，在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套，以避免不同实验区交叉污染。
装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体离至管底，降低污染手套或加样器的风险；谨慎开启反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。
吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行，遵守“慢吸快打”原则，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以避免气溶胶产生的交叉污染。
PCR试剂建议小量分装，以减少反复冻融、重复取样次数；多样本PCR反应时，先配制反应混合液分装至反应管中，加入样本核酸，请勿同时开盖，尽量**单人单管，实现完全闭管操作。
实验试剂应与样品和PCR产物分开保存，不应放于同处。
PCR扩增实验完成后及时将反应管取出，用一次性手套将产物反应管包裹丢弃，**管盖紧闭。
4、规范的实验设计：
应遵循实验室内部质量控制的相关规定，实验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照，全程质控实验过程，验证PCR反应的可靠性，并协助判断扩增系统的可信性。
三、PCR实验室的污染应急处理方法
1、若核酸样本溢出：
立即用布或纸巾覆盖，由向中心倾倒10%的次氯酸剂，约30分钟后，污染物品，再用次氯酸剂擦拭，并用75%酒精喷洒，移动紫外车**照射1小时。
2、其他不明情况污染：
1.暂停所有实验操作；
2.清理实验室内所有物品，寻找污染来源；
3.加大实验室的通风；
4.对实验室内所有表面（台面、地面及墙面） 进行；
5.75%酒精空中喷雾；
6.开启紫外装置，延长紫外照射时间（4小时以上）；
7.以上措施每日进行，直至污染；用新试剂及确认无污染的器材进行原污染项目的试剂空白检测，连续3次均阴性后方可进行常规检测。